INVESTIGAÇÃO DE BACTÉRIAS CLINICAMENTE RELEVANTES E PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS

INVESTIGATION OF CLINICALLY RELEVANT BACTERIA AND SUSTAINABILITY PROFILE FOR ANTIMICROBIANS

Beni Isac Silva Feitosa (Email:beniisac31@outlook.com),Vanderlene Brasil Lucena (Email:vanda_brasil@hotmail.com), Márcia Guelma Santos Belfort (Email:marciguelma@hotmail.com),Dominique Silva Lima (Email:dominique_lima123@outlook.com), Sheila Elke Araújo Nunes (Email:nunesearaujo@uol.com.br).

RESUMO: A ocorrência de linhagens bacterianas multirresistentes sustenta a hipótese que os Resíduos de Serviços de Saúde (RSS) atuam como reservatórios de marcadores de resistência aos antimicrobianos. Dessa forma, o estudo teve como objetivo identificar a ocorrência de bactérias clinicamente relevantes no chorume do lixão municipal e o seu perfil de susceptibilidade as drogas antimicrobianas de interesse clínico-microbiológico. O estudo foi conduzido no Lixão Municipal de Imperatriz, Maranhão. Foram coletadas 30 amostras de chorume in natura, em três pontos distintos. Os representantes do gênero Staphylococcus foram isolados a partir do crescimento em meio de cultura seletiva ágar hipertônico Manitol, enquanto os representantes da família Enterobacteriaceae e Bacilos Gram-Negativos não Fermentadores (BGNNF) as amostras foram cultivadas em meio de cultura seletivo Mac Conckey. Para a realização do teste de Susceptibilidade, as colônias bacterianas isoladas dos grupos de interesse clínico, foram transferidas para o meio de cultura ágar Muller-Hinton, posteriormente, os discos foram colocados de forma equidistante na superfície desse meio de cultura. Os resultados dos Teste de Susceptibilidade Antimicrobiana (TSA) realizada em triplicata, referente ao gênero Staphylococcus, mostrou-se efetivo ao antibiótico Azitromicina, enquanto o agente Ciprofloxina em apenas um teste apresentou resistência intermediária. Enquanto os agentes antimicrobianos testados em isolados da família Enterobacteriaceae, Amoxilina, Ciprofloxina e Cefalexina houve pouca efetividade quanto ao grupo dos BGNNF o agente Ciprofloxina foi efetivo em todos os testes. A avaliação do TSA mostrou que amostras de chorume coletado de Resíduos Sólidos Urbanos (RSU) descartados sem tratamento prévio no lixão municipal de Imperatriz-MA, permitem a sobrevivência de grupos bacterianos de relevância clínica, resistentes, resistentes intermediários e sensíveis a agentes antimicrobianos, disponíveis nas Unidades Básicas de Saúde (UBS).

PALAVRAS-CHAVE: Bacterianas Multirresistentes, Agentes antimicrobianos, TSA.

ABSTRACT: The occurrence of multiresistant bacterial strains supports the hypothesis that Healthcare Waste (RSS) acts as reservoirs of antimicrobial resistance markers. Thus, the study aimed to identify the occurrence of clinically relevant bacteria in the municipal dump leachate and their susceptibility profile to antimicrobial drugs of clinical-microbiological interest. The study was conducted at the Municipal Dump of Imperatriz, Maranhão. Thirty samples of fresh slurry were collected at three different points. Representatives of the genus Sta-phylococcus were isolated from growth in selective Manitol hypertonic agar culture medium, while representatives of the Enterobacteri-aceae family and non-Fermenting Gram-Negative Bacilli (BGNNF) samples were cultured in Mac selective culture medium. Conckey. To perform the Susceptibility test, bacterial colonies isolated from the clinical interest groups were transferred to the Muller-Hinton agar culture medium, and the disks were placed equidistantly on the surface of this culture medium. The results of the triplicate Antimicrobial Susceptibility Test (TSA) for the genus Staphylococcus proved to be effective for the antibiotic Azithromycin, while the Ciprofloxin agent in only one test showed intermediate resistance. While antimicrobial agents tested in isolates of the Enterobacteriaceae family, Amoxylin, Ciprofloxin and Cephalexin, there was little effectiveness in the group of BGNNF, the Ciprofloxin agent was effective in all tests. The TSA evaluation showed that leachate samples collected from Urban Solid Waste (MSW) discarded without previous treatment in the municipal dump of Imperatriz-MA, allow the survival of clinically relevant, resistant, intermediate resistant and antimicrobial-sensitive bacterial groups available. in the Basic Health Units (UBS).

KEYWORDS: Multiresistant Bacterial, Antimicrobial Agents, TSA.

1. INTRODUÇÃO

No que tange a geração de resíduos sólidos pela população, enfrentamos sérios desafios, como a complexidade e diversidade existente quanto aos impactos ambientais provocados por esses resíduos. Entre os fatores de degradação ambiental, destacam-se os resíduos sólidos gerados na área de saúde (Resíduos de Serviços de Saúde – RSS), os quais representam uma peculiaridade importante, quando gerenciados inadequadamente, proporcionando uma fonte de risco potencial ao meio ambiente (TOGNOC, 2015).

A Política Nacional de Resíduos Sólidos (PNRS) intuída em 2010, por meio da Lei de nº 12.305, prevê o compartilhamento da responsabilidade sobre o ciclo de vida dos produtos e bens de consumo, envolvendo desde os fabricantes, distribuidores, até o consumidor final. Contudo, no que tange a conduta com medicamentos, observa-se lacunas na PNRS, pois a mesma não obriga os fornecedores a realizar o recolhimento dos fármacos vencidos ou desuso. (BUENO, WEBER, OLIVEIRA, 2009).

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) estima que entre 10 mil e 28 mil toneladas de medicamentos são descartados pelos consumidores no Brasil (CFF, 2013). De acordo com a ABRELPE (2017), estima que 256.941 toneladas de RSS foram coletadas pelos municípios, destes, aproximadamente 47,6% foram incinerados, 22,1% foram destinados a autoclaves e 2,7% Micro-ondas, enquanto 27,6% foram destinados de forma inadequada, compreendendo a destinação: sem tratamento prévio, em aterros, valas sépticas, lixões etc.

A quantidade de Resíduos Sólidos Urbanos (RSU) coletada diariamente no município de Imperatriz-MA foi de 204,0 (t/dia), cerca de 0,86 Kg produzidos por habitantes diariamente. O Lixão Municipal recebe cerca de 101.000 toneladas de RSU por mês (ABRELPE, 2011; MORAIS, 2013). Consta a presença de animais domésticos, o excesso de mosquitos e urubus; há no local o mau cheiro característico do ambiente advindo da liberação de gases resultantes da lixiviação de matérias orgânicas presentes, e a presença de pessoas residindo no lixão, onde desenvolvem suas atividades desprovidas de todo e qualquer método de segurança; como também há um público que apesar de não residir, executam suas atividades laborais (LEITE, 2015; BRANDÃO, 2016).

Dessa forma o presente trabalho teve como objetivo, identificar a ocorrência de bactérias clinicamente relevantes no chorume do lixão municipal de Imperatriz, Maranhão e o seu perfil de susceptibilidade a drogas antimicrobianas de interesse clínico-microbiológico.

3. METODOLOGIA

O estudo foi conduzido no município de Imperatriz, localizado a oeste do Estado do Maranhão. O município possui área territorial correspondente a 1.368,988 km² e população estimada em 258.682 habitantes (IBGE, 2019).

Para a realização do estudo, foram coletadas amostras de chorume in natura, na área do Lixão Municipal de Imperatriz, Maranhão, localizado as margens da “Estrada do Arroz”, MA-386, na zona rural do município, no sentido povoado Coquelândia.

As coletas ocorreram em dois períodos distintos, a primeira foi realizada no mês de outubro de 2017 (15 amostras coletadas) e a segunda realizada em junho de 2018 (15 amostras coletadas) para verificar existência de diferenças em relação a alternâncias dos períodos de baixa e alta pluviosidade.

Quanto à coleta das amostras de chorume, foram utilizadas pipetas graduadas (20 mL) e com auxílio de um pipetador pode-se coletar alíquotas de 10 mL de chorume in natura em 3 pontos distintos do Lixão municipal, sendo coletado 5 amostras de cada ponto. As amostras foram acondicionadas em tubos Falcon (Foto 1) e em seguida transportadas para o Laboratório de Microbiologia e Saúde da Universidade Estadual da Região Tocantina do Maranhão (UEMASUL).

Foto 1: Coleta de amostras de chorume in natura no lixão municipal de Imperatriz- MA.

Fonte: Autor, 2018.

Para isolar os representantes do gênero Staphylococcus spp. foi realizado inicialmente a semeadura em meio de cultura seletiva ágar hipertônico Manitol, em seguida foram realizados testes bioquímico-fisiológicos convencionais de catalase, motilidade e avaliação da morfologia celular pela coloração de Gram.

Quanto aos representantes da família Enterobacteriaceae e BGNNF as amostras foram cultivadas em meio de cultura seletivo Mac Conckey. As amostras suspeitas para Enterobacteriaceae e BGNNF foram semeadas em meio de cultura seletivo ágar bile verde brilhante e incubadas a 35ºC no período 48 horas. A partir das colônias de Staphylococcus cultivadas em meio Manitol e Enterobacteriaceae e BGNNF cultivadas em meio Mac Conkey, foram transferidas para tubos de ensaio contendo de 3 a 5 mL de solução a 0,9% de NaCl com turbidez equivalente a 0,5 na escala de McFarland. Em seguida a solução de NaCl contaminada com as colônias de interesse, foram transferidas para o meio de cultura ágar Muller-Hinton, posteriormente, os discos foram colocados de forma equidistante na superfície desse meio de cultura (ANVISA, 2004).

A avaliação do Teste de Susceptibilidade a Antimicrobiano (TSA) por Disco-difusão seguiu os critérios preconizados pela National Committee for Clinical Laboratory Standards (2005). Para a seleção dos antibióticos utilizou-se a Relação de Medicamentos Básicos Municipais disponibilizados através da Central de Assistência Farmacêutica do município.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir do cultivo de colônias em Manitol para o teste de fermentação de carboidratos, foram isolados os principais representantes do grupo Cocos Gram-positivos. As colônias com as características morfológicas das amostras, coletadas no pontos: 1, 2 e 3 do período seco e 2 e 3 do período chuvoso, onde o meio ao redor das colônias tornaram-se amarelados (Foto 2 e 3), foram coletadas para a realização do teste bioquímico-fisiológico convencionais, onde verificou-se: positividade para o teste de catalase; motilidade negativa e arranjos morfológicos (cocos) em tétrade. Todos os testes realizados indicam a presença dos principais representantes do gênero Staphylococcus spp. nas amostras coletadas (Tabela 1).

Tabela 1: Testes bioquímico-fisiológicos convencionais para identificação dos representantes do gênero Staphylococcus spp.

Legenda: * Positivo (+); Negativo (-). Não houve crescimento de colônias bacterianas em meio de cultura seletivo Manitol, presuntivas de Staphylococcus spp. no Ponto 1 (-).

Fonte: Autor, 2018

Foto 2: Colônias de Staphylococcus, Foto 3: Colônias de Staphylococcus,

(períodos de alta pluviosidade). (períodos de baixa pluviosidade).

Bactérias Gram-positivas, em especial os cocos, estão entre os mais frequentes isolados de amostras biológicas humanas, lixiviados de RSU, RSD e RSS, como aponta diversos estudos, assim como os nossos achados que confirmam a presença de grupos pertencentes ao gênero Staphylococcus ssp. em RSU do Lixão Municipal de Imperatriz- MA.

A contaminação por microrganismos patogênicos em amostras Resíduos Sólidos Domiciliares (RSD) e de Serviço de Saúde (RSS), confirmam a presença de Staphylococcus aureus, tanto em RSD como RSS, além da identificação de outros grupos bacterianos de relevância clínica (CHAYB e KOZUSNY-ANDREANI, 2015).

Por conseguinte, considerando os riscos de disseminação de microrganismos potencialmente patogênicos em RSS foi constatado a presença de Staphylococcus spp. em amostras de chorume coletadas, foram isoladas 73 amostras positivas para esse gênero bacteriano (NASCIMENTO et al., 2009).

Para o isolamento dos representantes da família dos Bacilos Gram-Negativos não Fermentadores (BGNNF) e Enterobacteriaceae, foram realizados o cultivo para a verificação de fermentação em meio de cultura ágar Mac Conckey, as culturas incolores e com coloração rosa, indicaram respectivamente a não fermentação e fermentação de lactose. Suas respectivas amostras foram semeadas em meio seletivo ágar Bile Verde Brilhante como teste de fermentação em tubos de ensaio, os meios de cultura com coloração vermelha indicam a presença de não fermentadores (Enterobacteriaceae) e coloração Amarela com deslocamento de meio de cultura para os fermentadores de lactose (BGNNF).

De acordo com a Tabela 2 verificou-se maior positividade para o teste de fermentação em lactose no período de alta pluviosidade (12 amostras positivas) em contrapartida aos testes negativos para fermentação com menor significância (3 amostras negativas). Quanto aos testes realizados no período de baixa pluviosidade houve predominância em relação aos não fermentadores (9 amostras) e enquanto os fermentadores foram contabilizados em apenas três amostras (Foto 4 e 5).

Tabela 2:Demostração da fermentação positiva e negativa em meio de cultura seletivo em diferentes períodos pluviométricos de 2017 e 2018.

* Positivo (+); Negativo (-); Amostra (A).

Os achados de bacilos Gram-negativos em nossas amostras são sugestíveis da presença de Enterobacteriaceae (bacilos Gram-negativos fermentadores – BGNNF) e Bacilos Gram-negativos não fermentadores. Assim como o estudo bacteriológico realizado, a partir de amostras de RSD e RSS coletadas de um aterro experimental, foram identificados diferentes estirpes de Enterobacterias em RSD (77 isolados de 100 amostras coletadas) e RSS (56 isolados de 100 amostras coletadas) (QUINTAES, 2013).

Além disso, os estudos realizados, com pacientes internados em hospitais, numa amostra de 100 isolados clínicos analisados, proveniente de hemoculturas 30 eram bacilos Gram-negativos pertencentes à família Enterobacteriaceae (SILVA, 2014). Em estudo feito a partir de laudos de pacientes internados em um hospital de Porto Alegre, RS foram encontrados 326 isolados de BGN-NF cerca de 65% eram Pseudomonas aeruginosa e 16% Acinetobacter baumannii 16,5% (DELIBERALI et al., 2011).

Os resultados dos testes de susceptibilidade a antimicrobianos são mostrados na Tabela 3 e estão apresentados em termos do diâmetro do halo de inibição, em mm, referentes ao agente microbiano testado. Para o TSA realizado com os representantes de enterobacteciaceae (Foto 6); gênero Staphylococcus ssp. (Foto 7) e BGNNF (Foto 8); foram selecionados os disco de antibiograma referente aos agentes antimicrobianos: amoxilina; azitromicina; cefalexina e ciprofloxina, principais antibióticos disponíveis nas Unidades Básicas de Saúde de Imperatriz-MA.

O TSA realizado em triplicata, referente ao gênero Staphylococcus, mostrou-se efetivo ao antibiótico Azitromicina enquanto o agente Ciprofloxina em apenas um teste apresentou resistência intermediária. Os agentes antimicrobianos testados em isolados da família Enterobacteriaceae, Amoxilina (T1= 8 mm; T2 e T3= 0), Ciprofloxina (T1= 19 mm; T2=11 e T3= 13) e Cefalexina (T1, T2 e T3= 0) houve pouca efetividade quanto ao grupo dos BGNNF o agente Ciprofloxina (T1= 17 mm; T2=7 e T3= 14) foi efetivo em todos os testes.

Tabela 3: Demonstração do teste de Susceptibilidade Antimicrobiana (TSA) na difusão em disco a partir de isolados bacterianos de amostras de chorume do lixão municipal de Imperatriz-MA em períodos pluviométricos distintos de 2017 a 2018.

Resistência (R)/Intermediário (I)/Sensibilidade (S) **Teste (T); Amoxilina (AMC) Azitromicina (AZI); Cefalexina (CFE); Ciprofloxacina (CIP).

Foto 6: Demonstração do TSA realizado a partir de cepas isoladas de Enterobacteriaceae isoladas de chorume do lixão municipal de Imperatriz- MA em períodos pluviométricos distintos de 2017 a 2018.

Fonte: Autor, 2018

Foto 7: Demonstração do TSA realizado a partir de cepas isoladas de Staphylococcus isoladas de chorume do lixão municipal de Imperatriz-MA em períodos pluviométricos distintos de 2017 a 2018.

Fonte: Autor, 2018

Foto 8: Demonstração do TSA realizado a partir de cepas isoladas de BGNNF isoladas de chorume do lixão municipal de Imperatriz- MA em períodos pluviométricos distintos de 2017 a 2018.

Fonte: Autor, 2018

A avaliação de susceptibilidade a antimicrobiano mostrou que amostras de chorume coletado de RSU descartados sem tratamento prévio no lixão municipal de Imperatriz- MA, permitem a sobrevivência de grupos bacterianos de relevância clínica, resistentes, resistentes intermediários e sensíveis a agentes antimicrobianos, assim como os seguintes estudos realizados a partir de isolados provenientes de amostras de RSD e RSS.

Em chorume coletados de aterro sanitário em Juiz de Fora- MG apresentou elevadas taxas de linhagens de bactérias resistentes a diferentes agentes antimicrobianos de uso clínico e hospitalares, em relação à taxa de resistência para Staphylococcus a maior taxa foi para eritromicina (57%), entretanto, assim como, os achados da presente pesquisa, houve inibição quanto ao antimicrobiano Ciprofloxina (25%). Em relação à família enterobacteriaceae e BGNNF o antibiótico menos efetivo foram, respectivamente, a ampicilina e cloranfenicol (NASCIMENTO et al., 2009).

A partir da caracterização microbiológica de lixiviados gerados por RSD e RSS na cidade do Rio de Janeiro-RJ, dos 1232 isolados de Gram-negativos em amostras de RSS, 655 apresentou sensibilidade; 175 resistência intermediária e 402 estirpes foi verificado resistência, enquanto os 540 isolados de Gram-positivos, 374 apresentou sensibilidade; 47 resistência intermediária e 119 apresentou resistência (COSTA E SILVA, 2011).

Em isolados bacteriano de amostras de chorume, animais e trabalhadores de um aterro sanitário localizado na cidade de Campos dos Goytacazes-RJ, foi constatado a presença de 47 isolados bacterianos de animais e humanos pertencentes ao gênero Staphylococcus sp. sendo que, apenas uma cepa (2,1%) foi verificado sensibilidade a todos os antimicrobianos testados e 29 cepas (61,7%) apresentou-se resistentes a 3 ou mais antimicrobianos testados, constatando padrão de multirresistência (SERAFIM, 2013).

Apesar dos achados, para sensibilidade ao antimicrobiano azitromicina e ciprofloxacina para o gênero Staphylococcus e BGNNF em contrapartida a resistência e resistência intermediária aos antimicrobianos Amoxilina, ciprofloxacina e cefalexina em relação aos isolados da família enterobacteriaceae, linhagens resistentes a antimicrobianos, apontados em estudos a partir de isolados bacterianos de RSU tornam-se de suma importância no contexto atual, no que diz respeito ao uso indiscriminado de antimicrobianos e o contato direto por profissionais de limpeza, área da saúde e catadores de recicláveis.

5. CONCLUSÃO

Com base nos resultados apresentado, tanto os achados de bactérias de interesse clínico como a presença de grupos resistentes aos antimicrobianos testados, pressupõem que os RSU sem o devido tratamento adequado, segundo as normas vigentes, proporcionam impactos socioambientais, principalmente a saúde hu­mana e animal, além de serem reservatórios de grupos patogênicos, atuam como reservatórios de marcadores de resistência bacterianos.

Portanto, a partir dos nossos achados, existe a necessidade de mais estudos na área do lixão municipal de Imperatriz, maranhão, para fins de diagnose dos impactos socioambientais a curto, médio e longo prazo, no que tange a contaminação do solo e do ar, corpos d’agua superficiais e subterrâneos, assim com a garantia de assistência à saúde e segurança dos trabalhadores da comunidade do lixão municipal, que utilizam os RSU como fonte de subsistência. Além disso, a necessidade da criação de aterro sanitário, em substituição ao lixão “a céu aberto”, prática proibida de acordo com PNRS.

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