ISSN 1678-0701
Número 68, Ano XVIII.
Junho-Agosto/2019.
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No. 68 - 11/06/2019
AÇÃO DE TOXICIDADE DOS AGROTÓXICOS ATRAZINA E ÁCIDO 2,4-DICLOROFENOXIACÉTICO NA LEVEDURA FLEISCHMANN®  
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AÇÃO DE TOXICIDADE DOS AGROTÓXICOS ATRAZINA E ÁCIDO 2,4-DICLOROFENOXIACÉTICO NA LEVEDURA FLEISCHMANN®



Débora Tavares Sarabia (deborasarabia@hotmail.com)1, Larissa Pires Mueller (laripiresmueller@gmail.com)1, Maria do Socorro Mascarenhas Santos (maria_mascarenhas@outlook.com)2 Margareth Batistote (margareth@uems.br)3



1 Mestranda no Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais, Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul

2 Doutoranda em Recursos Naturais, Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul

3 Docente no Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais, Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul



Resumo

O estudo visa avaliar o potencial da utilização da levedura Fleischmann® como uma ferramenta para teste de citotoxicidade, frente aos agrotóxicos atrazina e 2,4-D. A levedura apresentou sensibilidade quando exposta aos compostos e pode servir como bioindicador eficaz para analises ambientais.

Palavras chave: citotoxicidade, agente estressor, meio ambiente.



Abstract

The aim of this study is to evaluate the potential of the use of FleischmannTM yeast as a tool for cytotoxicity testing, against the pesticides atrazine and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). The yeast showed sensitivity when exposed to the compounds and can serve as an effective bioindicator for environmental analyzes.

Keywords: cytotoxicity, stressor agent, environment.



INTRODUÇÃO

Na atualidade a preocupação com as questões ambientais estão em constante debate principalmente em relação a contaminação e a poluição, do solo e da água no mundo (STEFFEN, STEFFEN e ANTONIOLLI, 2011). As palavras poluição e contaminação possuem diversos sinônimos, por exemplo um determinado local só é tido como poluído quando certo composto causa prejuízo aos componentes de um ecossistema e acabam afetando as suas funcionalidades, já a contaminação é quando há algum elemento químico causando alterações relacionadas as concentrações naturais encontradas no ambiente (ZASSO et al., 2014).

Dessa maneira, as substâncias tóxicas podem estar presentes em diferentes concentrações tanto no ar, como na água e no solo (XU et al., 2019 e FAN et al., 2018). Ademais, as ações altamente poluidoras são formadas por compostos como, surfactantes, emulsificantes e muitos compostos são originados de práticas agrícolas representados por elementos inorgânicos como, o fosfato, os metais pesados (Pb, Cd, Hg, Cr e As) e o nitrato, no entanto ainda há os resíduos industriais que advêm da fabricação de fertilizantes, fabricação de tintas, entre outros, já em relação aos contaminantes orgânicos mais relatados são os resíduos domésticos, agroindustriais, petroquímicos, os agrotóxicos, dentre outros que ao ser descartado de forma incorreta causam vários malefícios tanto para a saúde como para o meio ambiente (OLIVEIRA, 2017; SISINNO e OLIVEIRA-FILHO, 2013).

Para o aumento da produção alimentícia em larga escala e a expansão de áreas cultivadas, fez-se necessário o uso de substâncias sintéticas cada vez mais utilizadas para o controle de patógenos que podem interferir de maneira direta na produtividade (RAMAKRISHNAN et al., 2019). No entanto, os efeitos da utilização de agrotóxicos se refletem de maneira negativa no meio ambiente, atingindo, solo, água, entre outras partes do meio ambiente, acarretando prejuízos a biodiversidade, além disso aplicação frequente leva à dependência a este composto (CARVALHO, 2018; MFARREJ e RARA, 2019).

Segundo Ferreira (2015), as condições climáticas são fatores que interferem na aplicação do agrotóxico nas plantações, pois só uma porcentagem acaba atingindo realmente o alvo inicial, considera-se o restante então como xenobiótico com alto grau de dispersão no meio ambiente, sendo depositado no solo, em ambientes aquáticos, sobre plantas, levando muitas vezes a bioacumulação. Já para Ribas e Matsumura (2009), muitos fatores estão envolvidos na dissipação dos agrotóxicos, levando à mineralização completa da molécula ou gerando outros produtos como metabólitos. Assim, os processos envolvidos no comportamento ambiental do agrotóxico dependem de suas propriedades físico-químicas, da forma de aplicação, nas características do solo, das condições ambientais e outros que determinam a sua destinação ambiental, tais como a lixiviação, o escoamento superficial, a sorção, a infiltração, a degradação química e biológica, a volatilização, como observado na figura 1.

A degradação ambiental realizada pelos diferentes organismos presente no meio ambiente apresentam características que propiciam uma resposta dinâmica na presença de substâncias xenobióticas, tais respostas podem estar relacionadas com as alterações de sua fisiologia, morfologia e adaptações em virtude da capacidade para acumular substâncias, tendo em vista que, a utilização de microrganismos oportuniza a possibilidade da realização de uma avaliação mais elaborada da toxicidade dos compostos e também os seus efeitos a nível celular (FRANCISCO e DE QUEIROZ, 2018). Outros fatores são considerados como vantajosos estão entre eles, o custo, o tempo de análise, a minimização de resíduos gerados durante os estudos entre outros (DOS SANTOS et al., 2012).

Neste sentido as leveduras podem ser utilizadas como bioindicadores, uma vez que são de fácil aquisição, rápida propagação, não patogênicas e de fácil manutenção em condições controladas, por não apresentarem variações como as encontradas em organismos complexos além de apresentarem sensibilidade a diferentes substâncias (HAGLER, 2006). A toxicidade dos pesticidas em leveduras pode variar dependendo de sua estrutura química e o mecanismo de ação e estes estão fortemente relacionados com a natureza da molécula (DOS SANTOS et al., 2012).

Os Bioensaios utilizando Saccharomyces cerevisiae para analisar a ação toxicológica dos pesticidas tem como fundamento a análise do metabolismo celular frente aos compostos tóxicos (RÉGO, 2018). Contudo, as leveduras ainda são pouco exploradas como indicadoras de toxicidade no meio ambiente. Assim este estudo visa avaliar o potencial da utilização da levedura Fleischmann® como uma ferramenta para testes de citotoxicidade.



MATERIAL E MÉTODOS



Microrganismo

A levedura utilizada neste estudo foi a Fleischmann® adquirida no comércio local na cidade de Dourados do Estado do Mato Grosso do Sul.



Preparo das Soluções de Agrotóxicos

Os agrotóxicos Atrazina e o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4 D), foram gentilmente cedidos pela Embrapa Oeste-Dourados/MS, para a realização deste estudo. Os padrões foram preparados a partir de uma solução estoque de 100 mg L-1 em ambos os compostos e diluídos na proporção de 1 mL em 99 mL de metanol para obter a concentração final de 1000 µg L-1 com o volume final de 100 mL. As soluções foram mantidas em frasco âmbar e estocadas a -18ºC.



Teste de citotoxicidade e mecanismo de floculação



Para analisar a ação citotóxica dos compostos frente a levedura, as células foram crescidas em frascos Erlenmeyer contendo 0,1 g de levedura liofilizada, 20 mL de água ultrapura e 2,0 g de sacarose, sendo adicionadas as concentrações (0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 µg L-1) dos agrotóxicos e incubadas a 30 º C nos tempos de 30, 60 e 90 minutos a 250 rpm e alíquotas foram retiradas para contagem em câmara de Neubauer utilizando o corante azul de metileno.

Para a avaliação da floculação as amostras foram coletadas no tempo de 90 minutos e alíquotas 10 µL foram retiradas e adicionadas em eppendorf contendo 90 µL do corante azul de metileno, logo após foram adicionadas 5 µL das amostras sobre uma lâmina e recoberta por uma lamínula e com o auxílio de um microscópio ótico foram analisadas, de forma qualitativa e fotografadas, sendo quantificadas quanto a presença de floculação ou não floculação, em relação as características fenotípicas. Os experimentos foram realizados em triplicata.



Análise estatística

Os dados obtidos foram analisados com o software Excel 16 da Microsoft, sendo apresentados as médias.



RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Avaliação da ação citotóxica dos agrotóxicos atrazina e do 2,4 D, os dados mostram que houve aumento na taxa de mortalidade da levedura Fleischmann®, gradativamente em ambos os agrotóxicos em relação as concentrações dos compostos e ao tempo de exposição frente o agente estressor. Contudo observa-se que a exposição da levedura ao composto 2,4 D apresentou uma maior tendência na taxa de mortalidade em relação ao tempo de 90 minutos nas condições analisadas, possivelmente este composto ocasionou uma maior citotoxicidade para a levedura (Figura 1).

O uso de agrotóxicos tem levado a uma série de problemas toxicológicos em organismos não alvo. Para detectar a presença destes compostos nos diferentes compartimentos ambientais estão sendo utilizadas como bioindicadores a Saccharomyces cerevisiae (KITAGAWA et al., 2002). Portanto, este microrganismo tem se mostrado como um modelo experimental importante para avaliar as alterações na expressão de genes relacionados a poluentes ambientais, especialmente produtos químicos e agrícolas (RUMLOVA e DOLEZALOVA, 2012).

Figura 1. Avaliação da ação citotóxica na levedura Fleischmann® nos tempos (A. 30 min; B. 60 min e 90 min), dos agrotóxicos atrazina e 2,4D em diferentes concentrações. Fonte: Autores.

A avaliação do mecanismo de floculação em relação a característica fenotípica, foi visualmente categorizada pela formação de flocos. Foi observado uma crescente formação de flocos em relação as concentrações dos compostos analisados. Contudo observou-se uma maior adesão celular nas concentrações 3,0 e 4,0, de ambos os agrotóxicos, porém na concentração de 5,0 µg L-1 do composto 2,4 D esta interação celular propiciou uma floculação mais evidente. Possivelmente tais concentrações dos agentes estressores analisados, tenha induzido o gene FLO1 a formação de floculinas, proteínas responsáveis pela floculação (Quadro 1).

Para North e Vulpe (2010), a desrepressão de genes ocorre em relação aos efeitos tóxicos e até mesmo ao tempo de exposição ao agente estressor, fornecendo uma ligação direta com o agente tóxico. Segundo Moreno-García (2018), a Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo não floculante, contudo apresenta mecanismo de defesa quando há um agente estressor externo, o que propicia a união entre si, acionando o seu mecanismo de floculação, ou seja, a adesão de célula-célula visando sua proteção e sobrevivência.

Os agrotóxicos estão dispersos em vários compartimentos ambientais e podem ter ação citotóxica em relação aos organismos vivos, no que diz respeito a concentração, tempo de exposição e outras condições. Neste estudo podemos observar que a levedura Fleischmann® mostrou ser uma importante ferramenta utilizada como bioindicador, este microrganismo mostrou uma eficiente resposta adaptativa frente aos agentes estressores nas condições analisadas.

Quadro 1. Imagens do perfil de floculação e não floculação da levedura Fleischmann® nas diferentes concentrações dos agrotóxicos ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e atrazina.

Fonte: Autores.

O perfil de floculação, foi analisado visualmente e foram quantificados em relação a floculados e não floculados. Visto que no controle negativo não ocorreu alteração do fenótipo em ambos agrotóxicos analisados, foi observado que a levedura Fleischmann®, desenvolveu o mecanismo de floculação a partir das maiores concentrações em relação aos compostos 2,4 D e atrazina (Tabela 1).

Sob condições de estresse, as leveduras apresentam a capacidade de se agregar devido as interações hidrofóbicas que ocorrem na parede celular, tais alterações podem aumentar a hidrofobicidade das células propiciando a adesão celular e levando a uma mudança adaptativa (LOPES et al., 2015). De acordo com Rossouw et al., 2015 o mecanismo de floculação pode estar associado a respostas celulares adaptativas de autoproteção frente a estressores do meio externo. Neste estudo podemos observar que ocorreu o mecanismo de floculação nas concentrações mais elevadas dos agrotóxicos analisados, possivelmente isto tenha levado a levedura a desenvolver a capacidade de floculação.

Tabela 1. Avaliação quantitativa da capacidade de floculação na levedura em relação as concentrações de agrotóxicos.

AGROTÓXICO

CONCENTRAÇÕES (µg L-1)


Controle

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

2,4 D


-

-

+

+

++

+++

Atrazina

-

-

-

+

+

++







Os símbolos indicam o perfil de floculação das leveduras como, – (nenhuma floculação), + (pouca floculação), ++ (media floculação) e +++ (alta floculação). Fonte: Autores.



CONCLUSÃO

Constatou-se crescente taxa de mortalidade da levedura frente aos agrotóxicos analisados, contudo a levedura sofreu maior ação citotóxica em relação ao agente estressor 2,4 D. O mecanismo de floculação mostrou alteração no perfil fenotípico com a maior formação de flocos na concentração 5µg L-1 no composto 2,4 D. A levedura Fleischmann® apresentou sensibilidade em relação aos compostos analisados e pode ser considerada um bioindicador eficaz para análises ambientais.



AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul (FUNDECT), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais (PGRN) e Embrapa Agropecuária Oeste.



REFERÊNCIAS

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DOS SANTOS, S. C.; TEIXEIRA, M. C.; CABRITO, T. R. e SÁ-CORREIA, I. Yeast toxicogenomics: genome-wide responses to chemical stresses with impact in environmental health, pharmacology, and biotechnology. Frontiers in genetics, p. 63, 2012.

FAN, F. M.; MESQUITA, M. O.; SANTOS, V. C. F.; LUCAS, E. O.; ZANELLA, R.; PRESTES, O. D. e BANDEIRA, N. M. G. Resíduos de agrotóxicos em água e solo de município em região produtora de fumo no Rio Grande do Sul. Saúde coletiva, desenvolvimento e (in) sustentabilidades no rural. p. 89-108, 2018.

FERREIRA, M. L. A pulverização aérea de agrotóxicos no Brasil: cenário atual e desafios. Revista de Direito Sanitário, p. 18-45, 2015.

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KITAGAWA, E.; TAKAHASHI, J.; MOMOSE, Y. e IWAHASHI, H. Effects of the pesticide thiuram: genome-wide screening of indicator genes by yeast DNA microarray. Environmental science & technology, p. 3908-3915, 2002.

LOPES, M. L.; PAULILLO S. C. L., CHERUBIN, R. A.; GODOY, A.; NETO, H. B. A. e AMORIM, H. V. Linhagens de Leveduras Personalizadas® para Produção de Etanol: Seleção Dirigida pelo Processo. Piracicaba: Fermentec Tecnologias em Açúcar e Álcool Ltda., p. 42, 2015.

MFARREJ, M. F. B. e RARA, F. M. Competitive, Sustainable Natural Pesticides. Acta Ecologica Sinica, p. 145-151, 2019.

MORENO-GARCÍA, J.; GARCÍA-MARTINEZ, T.; MORENO, J.; MAURICIO, J. C.; OGAWA, M.; LUONG, P. e BISSON, L. F. Impact of Yeast Flocculation and Biofilm Formation on Yeast-Fungus Coadhesion in a Novel Immobilization System. American Journal of Enology and Viticulture, p. 278-288, 2018.

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OLIVEIRA, D. Toxicidade multigeracional do fipronil para Folsomia candida em solo natural tropical (Multigenerational toxicity of fipronil to Folsomia candida in tropical natural soil). Dissertação (Mestrado em Tecnologia na área de Ambiente) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia, Limeira, SP, p. 65, 2017.

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