ISSN 1678-0701
Número 69, Ano XVIII.
Setembro-Novembro/2019.
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No. 69 - 27/09/2019
AMBIENTES NATURAIS: UMA FONTE PROMISSORA PARA PROSPECÇÃO DE LEVEDURAS  
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AMBIENTES NATURAIS: UMA FONTE PROMISSORA PARA PROSPECÇÃO DE LEVEDURAS



NATURAL ENVIRONMENTS: A PROMISING SOURCE FOR PROSPECTING YEAST



Elane Galvão dos Santos1; Maria do Socorro Mascarenhas Santos2; Poliana Galvão dos Santos3; Margareth Batistote4.



1Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Ambiental Universidade Federal da Grande Dourados-UFGD, elanegalvao.santos@gmail.com;

1Mestranda do Programa de Pós-Graduação de Entomologia e Conservação da Biodiversidade - Universidade Federal da Grande Dourados-UFGD, polianagalvao.santos@gmail.com;

2Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais - Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul – UEMS, maria_mascarenhas@outlook.com; margareth@uems.br;

2Profa. Dra. em Biotecnologia, docente do Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais - Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul – UEMS, margareth@uems.br;



Resumo: O cerrado é um bioma muito importante em termos de diversidade de espécie tanto da fauna como da flora. Dentro deste habitat são encontrados além de plantas e animais endêmicos uma grande variedade de microrganismos como bactérias, fungos e leveduras que possuem um papel essencial dentro do ecossistema. É notório que as condições de preservação do meio ambiente podem interferir tanto na diversidade como influenciar na capacidade metabólica destes organismos. Assim este estudo visa isolar leveduras de fontes naturais e avaliar seu perfil fermentativo. O isolamento foi realizado através de diluições seriadas e plaqueamento em meio sólido YPD 2% incubadas em estufa a 30°C. As colônias isoladas foram utilizadas para o teste de capacidade fermentativa, realizado em tubos de ensaio contendo tubos de Duhran invertidos com meio fermentativo YP acrescido das fontes de carbono (glicose, lactose, sacarose, frutose, manose, maltose, neomalt, amido). Foi utilizado a levedura Catanduva-1 como padrão de comparação. Os isolados A2, A4, A5, e A6 apresentaram capacidade fermentativa na maioria, sendo que os isolados A4, A5, e A6 utilizaram à maioria dos açúcares exceto a lactose. O isolado A6 mostrou um perfil fermentativo semelhante a levedura padrão.

Palavras-chave: Cerrado, biodiversidade, microrganismos



Abstract: The cerrado is a very important biome in terms of diversity of species of both fauna and flora. Within this habitat are found in addition to endemic plants and animals a wide variety of microorganisms such as bacteria, fungi and yeasts and play an essential role within the ecosystem. It is notorious that the conditions of preservation of this environment can interfere in this diversity and also influence in the metabolic capacity of these organisms. Such conditions also limit their survival. Thus this study Thus, this study aims to isolate yeasts from natural sources and evaluate their fermentative profile. Isolation was performed by serial dilutions and plating in 2% YPD solid medium incubated in an oven at 30 °C. The isolated colonies were used for the fermentation test, carried out in test tubes containing Duhran tubes inverted with YP fermentation medium plus carbon sources (glucose, lactose, sucrose, fructose, mannose, maltose, neomalt, starch). Catanduva-1 yeast was used as the standard of comparison. Isolates A2, A4, A5, and A6 were mostly fermentative, with isolates A4, A5, and A6 using most sugars except lactose. Isolate A6 showed a fermentative profile similar to standard yeast.

Keywords: Cerrado, biodiversity, microorganism



INTRODUÇÃO

O bioma Cerrado possui uma importância no que tange as questões da biodiversidade, uma vez que abriga plantas, organismos e microrganismos endêmicos. É um ambiente constituído por um conjunto com formações vegetais de aspectos específicos e variação de fisionomia. Assim, a sua vegetação possui como características a presença de árvores de porte baixo com troncos e galhos retorcidos que junto com a vegetação rasteira forma um cenário similar as savanas da África do Sul (MEDEIROS, 2011).

Este bioma sofre com os impactos ambientais antrópicos se sobressaindo, principalmente, das queimadas. Embora este bioma seja considerado aparentemente frágil, dada a sua característica de flora, ele apresenta um potencial de reestruturação frente as condições de degradação, isso se deve ao fato da sua diversidade de espécies tanto da macro como da microbiota presente neste ambiente. Neste sentido é conhecido e denominado de “hotspots” mundiais, ou seja, um dos biomas mais ricos e ameaçados do planeta de acordo com o Ministério do Meio Ambiente (2007).

De acordo com Medeiros (2011), este bioma apresenta alta taxa de plantas endêmicas. Assim, estes ambientes preservados são tidos como uma reserva que abriga uma imensa quantidade de microrganismos que ainda são pouco explorados, mas que podem apresentar grande potencial, pois podem apresentar grande diversidade genética e funcional dada a sua evolução adaptativa e, por conseguinte na pressão seletiva que estes microrganismos passaram no decorrer dos anos (DIONISI; LOZADA; OLIVERA, 2012).

Na natureza os microrganismos podem ser amplamente encontrados e possuem um papel importante dentro do ecossistema sendo responsáveis pela ciclagem dos resíduos orgânicos e minerais e, atuam também na degradação dos poluentes presentes no ambiente auxiliando, com isso, na manutenção do equilíbrio do sistema (TORTORA, FUNKE e CASE, 2005). Sua capacidade metabólica e diversidade genética vem sendo exploradas ao longo das décadas, principalmente, impulsionadas pela possibilidade de uso em processos biotecnológicos (ARAÚJO, 2015).

O Brasil possui zonas biogeográficas distintas, que abrigam grande biodiversidade ecológica que ilustram o enorme potencial deste país para a realização de atividades como a prospecção de compostos oriundos de plantas e de microrganismos (MINISTERIO DO MEIO AMBIENTE, 2018). Um bom exemplo, está nas leveduras que suportam condições de estresse e conseguem sobreviver na natureza (LUCION, 2015). Estes microrganismos podem ser encontrados em diversos substratos como folhas, frutos, solo, ar, lagos, rios, mares ou habitando o interior de insetos e animais, principalmente em substratos que possuem açúcares e outras fontes de carbono de fácil assimilação. Compondo um dos grupos mais estudados na atualidade (BAI; ANDERSSON; MOO-YOUNG, 2008).

Contudo, as condições do meio ambiente podem influenciar e por vezes determinar as características da microbiota, assim se expostos a condições de degradação, presença de poluentes, variação de temperatura, pressão osmótica e pH, o mesmo microrganismo pode apresentar diferenças em seu metabolismo demonstrando sua habilidade de adaptação a diferentes condições e a ecossistemas distintos de acordo com Ohara (2014), podendo deste modo serem utilizados como bioindicadores de degradação do meio ambiente. Estes microrganismos são utilizados pelo homem desde a antiguidade na produção de diversos tipos de alimentos e na produção de bebidas fermentadas (HEINZ, 2014).

O meio ambiente preservado pode abrigar inúmeros organismos que podem trazer grandes benefícios, pois podem ser utilizados em bioprocessos, uma vez que do seu metabolismo pode-se obter compostos secundários de grande importância como os fármacos e enzimas que auxiliam nos processos biotecnológicos. No entanto, dada a diversidade destes na natureza, ainda existe muitos desconhecidos ou pouco estudados. Neste contexto, este estudo visa isolar leveduras de fontes naturais e apresentar suas características morfofisiológicas em diferentes condições de cultivo.



METODOLOGIA

Coleta das amostras e local de estudo

Foram coletadas amostras de diferentes fontes e locais a partir de ambientes naturais como solo, ninho de cupim, frutos e outros, que foram acondicionadas em sacos plásticos a 4ºC e levadas ao laboratório, sendo denominadas de Amostras (A) e identificadas com número (A2, A3, A4, A5 e A6). O estudo foi desenvolvido no laboratório de Biotecnologia, Bioquímica e Biotransformação do Centro de Pesquisa em Recurso Naturais – CERNA, na Universidade Estadual do Mato Grosso do Sul – UEMS – Dourados.



Isolamento das leveduras

As amostras foram homogeneizadas em solução salina (0,85%), em seguida foram realizadas diluições seriadas de 10-1, 10-2 e 10-3 e 100µL das diluições foram inoculadas em placas de Petri contendo o meio sólido YPD composto por extrato de levedura (10 g L-1), peptona (20 g L-1), dextrose (20 g L-1), e agar (20 g L-1), com adição de antibiotico Cloranfenicol (2% v v-1) e, espalhadas com o auxilio de uma alça de Drigalsk. Posteriormente foram incubadas em estufa a temperatura de 30°C por 72 horas. A linhagem de levedura industrial Catanduva-1 foi utilizada como padrão.



Análise da capacidade fermentativa e assimilação das diferentes fontes de carbono

O meio YP (extrato de levedura (10 g L-1), peptona (20 g L-1), foi suplementado com fontes de carbono (glicose, maltose, manose, sacarose, frutose, lactose, neomalt, amido) na concentração de 17ºBrix, sendo que 20mL foram acrescentadas em tubo de ensaio contendo tubo de Duhran invertido, este conjunto foi esterilizado em autoclave a 120°C por 20 minutos. Com o auxílio de uma alça de platina, uma colônia do isolado foi diluída em solução salina (0,85%) e 100µL foram inoculados em tubo de ensaio, mantidos em estufa por 24 horas a temperatura de 30ºC. A capacidade fermentativa foi analisada tanto pela presença de bolhas no tubo de Durhan como de espuma características de fermentação e concomitante foi realizada a análise de assimilação de açúcares através de um refratômetro portátil.



RESULTADOS e DISCUSSÕES

Neste estudo, a caracterização morfológica de leveduras isoladas de ambientes naturais apresentou colônias de aspectos distintos como mostra a (Tabela 1). Os dados mostraram que houve uma variação em relação ao aspecto tamanho das colônias dos isolados, sendo os menores diâmetros de 1 a 2mm para os isolados A2 e A3, os demais apresentaram uma média de diâmetro com colônias variando de 2 a 5 mm e apresentaram semelhanças quanto as demais características.

Estudos realizados sobre as características morfofisiológicas com leveduras industriais utilizadas para a produção de etanol, demonstraram que os aspectos morfológicos podem apresentar variações, uma vez que embora as colônias apresentem aspectos morfológicos semelhantes sua performance pode ser diferente. Os autores encontraram resultados semelhantes ao deste estudo, principalmente no que se refere as características textura sendo 100% brilhantes, com cor branca os isolados apresentaram crescimento de colônias com aspectos morfológicos semelhantes, mostraram que houve uma variação de tamanho entre as colônias de < 1mm a 2mm e todas as linhagens apresentaram uma textura brilhante. A cor predominante foi branca, com exceção para a linhagem Fleischmann que apresentou coloração rosa. A superfície das colônias apresentou-se lisa para a maioria das leveduras, sendo o mesmo observado para as bordas. A elevação predominante foi do tipo convexa Comparando os dados de nossos estudos com o da literatura, podemos observar que na avaliação da caracterização morfológica de linhagens padrão industriais para produção de etanol os aspectos morfológicos analisados apresentaram semelhanças entre si, no entanto os isolados selvagens mostraram uma maior diferença nos aspectos morfológicos analisados, evidenciando que há uma maior diversidade de microrganismos presentes no caldo de cana (MOREIRA et al., 2015),.

Quadro 1. Avaliação das características morfológicas de leveduras isoladas de ambientes naturais.

Morfotipos

Diâmetro (mm)

Textura

Cor

Borda

Elevação

Cat-1

2 a 5

Brilhante

Branca

Lisa

Convexa

A2

1 a 2

Brilhante

Branca

Lisa

Convexa

A3

1 a 2

Brilhante

Branca

Lisa

Convexa

A4

2 a 3

Brilhante

Branca

Lisa

Convexa

A5

2 a 3

Brilhante

Branca

Lisa

Convexa

A6

2 a 5

Brilhante

Branca

Lisa

Convexa

Fonte: Elaborado pelos autores.



Na avaliação da capacidade fermentativa dos isolados de leveduras a partir de fontes naturais, pode-se observar que os isolados A2, A4, A5, e A6 apresentaram indícios de fermentação nos açúcares analisados, o isolado A2 apresentou indícios de fermentação na lactose, contudo não fermentou a manose. O isolado A3 não apresentou fermentação na lactose, neomalt, maltose e amido, somente nas fontes de carbono sacarose, glicose e frutose. A levedura Cat-1 não fermentou em lactose e amido. Foi considerado positivo os tubos que continham produção de gás e uma turbidez e bolhas no interior dos tubos, importantes características de linhagens ditas como boas fermentadoras (Tabela 1).

O isolamento e a caracterização fisiológica de leveduras se mostram importante para a busca de novos isolados com bom perfil fermentativo os quais podem tornar os processos fermentativos mais eficientes. As técnicas bioquímicas e moleculares estão contribuindo para a identificação de linhagens com maior capacidade fermentativa (KURTZMAN; FELL; BOEKHOUT, 2011; BARATA et al., 2008).

Estudos realizados por Moreira et al. (2015), com as linhagens industriais Catanduva-1, Pedra-2, Red Star e Ragi Instan utilizando mosto a base de caldo de cana com diferentes concentrações de Brix (12, 15, 24 e 30°) demonstraram que as leveduras apresentam capacidade fermentativa nas concentrações de 12, 15 e 24º Brix, não apresentando indícios de fermentação na concentração de 30ºBrix considerada como alta.

Tabela1.Avaliação da capacidade fermentativa de isolados de leveduras de fontes naturais cultivadas em diferentes fontes de carbono.

Açucares

Cat-1

A2

A3

A4

A5

A6

Sacarose

+

+

+

+

+

+

Glicose

+

+

+

+

+

+

Frutose

+

+

+

+

+

+

Lactose

+

Neomalt

+

+

+

+

+

Manose

+

+

+

+

Maltose

+

+

+

+

+

Amido

+

+

+

+

Fonte: Elaborada pelos autores. (+) fermenta, (‒) não fermenta.

Na avaliação de assimilação de diferentes fontes de carbono, os isolados de leveduras de fontes naturais, a A2 apresentou assimilação das fontes de carbono mostrando possuir melhor afinidade a glicose e frutose. A amostra A6 apresentou certa similaridade com a padrão Cat-1, visto que assimilou a fonte de carbono glicose, frutose e sacarose. Os isolados A4, A5, e A6 apresentaram assimilação à maioria dos açúcares exceto para a lactose. O isolado A3 apenas assimilou as fontes sacarose, glicose e frutose (Tabela 2).

As leveduras utilizadas nos processos fermentativos para a produção de etanol devem apresentar capacidade de metabolizar a sacarose, glicose e frutose, pois, são as fontes de carbono encontradas na composição da matéria prima utilizada, a cana-de-açúcar (BASSO et al., 2011). Estudos desenvolvidos por Silveira (2013), com as cepas de leveduras industriais Ethanol RedTM, Pedra-2, Santa Adélia, Barra Grande e Catanduva-1, as quais foram submetidas a diferentes fontes de carbono (sacarose, glicose, frutose, maltose e galactose), observou que somente as linhagens Cat-1 e Barra Grande não assimilaram maltose, contudo houve consumo dos demais açúcares e que as demais linhagens metabolizaram as fontes de carbono.

Tabela 2. Assimilação das diferentes fontes de carbono por isolados de leveduras de fontes naturais, partindo de uma concentração inicial de 17° Brix.

Açucares

Cat-1

A2

A3

A4

A5

A6

Brix Final

Sacarose

10

15

16

14

14

15

Glicose

10

14

16

13

14

10

Frutose

11

14

15

13

13

12

Lactose

17

15

17

17

17

17

Neomalt

14

15

17

14

14

13

Manose

15

17

17

14

15

15

Maltose

14

15

17

15

15

15

Amido

17

15

17

15

15

15

Fonte: Elaborada pelos autores.



Conclusões

Na análise da capacidade fermentativa dos isolados de leveduras obtidas a partir de fontes naturais, os isolados A2, A4, A5, e A6 apresentaram desempenho fermentativo. Os isolados A2 e A6 assimilaram glicose e frutose, sendo que o A6 apresentou um perfil fermentativo semelhante ao da levedura padrão, sendo que os isolados A4, A5, e A6 utilizaram à maioria dos açúcares exceto a galactose.

Os ambientes naturais têm-se mostrado como um grande reservatório de organismos, assim preservá-los é de fundamental importância, para garantir a biodiversidade das espécies, principalmente, da microbiota que possuem a capacidade de produzir moléculas bioativas que podem ser utilizadas para vários processos biotecnológicos.



AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul (FUNDECT), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Ambiental/UFGD e ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais (PGRN)/UEMS.



REFERÊNCIAS

ARAÚJO, M. A. M. Isolamento e seleção de leveduras para produção de enzimas de interesse industrial a partir de frutos do Cerrado. 68 f.Dissertação (Mestrado) – Universidade Católica Dom Bosco, Campo Grande, 2015.

BARATA, A.; GONZALEZ, S.; MALFEITO-FERREIRA, M.; QUEROL, A.; LOUREIRO, V. Sour rot-damaged grapes are sources of wine spoilage yeasts. FEMS Yeast Research, v.8, p. 1008–1017, 2008.

BASSO, T. O.; DE KOK, S.; DÁRIO, M. G.; DO ESPIRITO-SANTO, J. C. A.; MÜLLER, G.; SCHLOLG, P. S.; SILVA, C. P.; TONSO, A.; DARAN, J. M.; GOMBERT, A. K.; VANMARIS, A. J. A.; PRONK, J. T.; STAMBUK, B. U. Engineering topology and kinetics of sucrosemetabolism in Saccharomyces cerevisiae for improved ethanol yield. Metabolic Engineering, v. 13, p. 694-703, 2011.

DIONISI, H. M.; LOZADA, M.; OLIVERA, N. L. Bioprospection of marine microorganisms: biotechnological applications and methods. Revista Argentina de Microbiología, v.44, p.49-60, 2012.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 8°edição. Porto Alegre: Artmed, 894 p., 2005.

MOREIRA, C. S.; SANTOS, M. S. M.; BARRO, N. S.; CARDOSO, C. A. L.; BATISTOTE, M. Análise dos parâmetros morfofisiológicos de linhagens de leveduras industriais com potencial biotecnológico para a produção de etanol. Ciência e Natura, v. 37, p. 55-63, 2015.

SILVEIRA, E. A. Caracterização bioquímica de leveduras industriais produtoras de etanol cultivadas em diferentes açúcares. 70 f. Dissertação (Mestrado) Instituto de Química de Araraquara, UNESP, Araraquara,2013.

MINISTERIO DO MEIO AMBIENTE. Biodiversidade Brasileira. Disponível em:<http://www.mma.gov.br/biodiversidade/biodiversidade-brasileira>. Acesso em: 19 agosto de 2018.

HEINZ, O. L. Isolamento de leveduras de amora-preta (Rubus sp.) visando fermentação alcoólica. 34 f. Trabalho de Conclusão de Curso (TCC). Universidade Tecnológica Federal do Paraná-Pato Branco. 2014.

LUCION, F. B. Isolamento, identificação e caracterização de leveduras isoladas do mirtilo. 77f. Dissertação (Mestrado) Pós-graduação em Ciências e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Santa Maria, 2015.

KURTZMAN, C.P.; FELL, J.W.; BOEKHOUT, J. The Yeasts, A Taxonomic Study, Fifthy edition. Elsevier, 1873 p, 2011.

BAI, F. W.; ANDERSSON, W. A.; MOO-YOUNG, M. Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks. Biotechnology. Advances, v. 26, p. 89 - 105. 2008.

OHARA, A. Isolamento e seleção de leveduras silvestres de biomas do Estado de São Paulo com potencial para produção de lipase e vitaminas do complexo B. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Engenharia de Alimentos - UNICAMP, Campinas-SP, 2014.

MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE - Biodiversidade do Cerrado e Pantanal: áreas e ações prioritárias para conservação/Ministério do Meio Ambiente. – Brasília: MMA, 2007. 540 p. (Série Biodiversidade 17).

MEDEIROS, J. D. Guia de campo: Vegetação do Cerrado 500 espécies. Brasília: Ministério do Meio Ambiente, Secretaria Nacional de Biodiversidade e Florestas, 534p. 2011.



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